革兰染色

革兰染色法,由丹麦病理学家Christain Gram于1884年创立,是细菌学中很重要的鉴别染色法,因为通过此法染色,可将细菌鉴别为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。

近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解,对革兰染色的机制提出不同的看法。一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚,经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小,结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色;而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄,交联疏松,脂肪含量高,经乙醇处理后部分细胞壁可能被溶解并改变其组织状态,细胞壁孔径大,不能阻止溶剂透入,因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此,革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别,也因物理结构不同结果不同,例如酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同,但具有革兰染色阳性反应。

这在简单染色中已讨论过,此处用结晶紫。

其作用是增强染料与细菌的亲和力,更好地加强染料与细胞的结合。常用的媒染剂是碘液。

帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同,而将细菌加以区分。革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色,而革兰阴性细菌则易被脱色。常用的脱色剂是丙酮或乙醇,这里所用的是95-的乙醇。

也是一种碱性染料,目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色,以便与未脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。

1。 涂片:左手持菌液试管,右手持接种环,用接种环从试管培养液中取一环菌,从酒精灯外焰穿过,于载玻片中央涂成薄层(事先在背面做好标记圆圈)即可,或先滴一小滴无菌水于载玻片中央,用接种环从斜面上挑出少许,与载玻片上的水滴混合均匀,涂成一薄层。

拔或塞试管塞时,应将试管口通过火焰略加烧灼,最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

2。 干燥:涂片后在室温下自然干燥,也可在酒精灯上略加温,使之迅速干燥,但勿靠近火焰。

3。 固定:常用高温进行固定。即手持载玻片一端,标本面朝上,在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次,共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃,以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜,放置待冷后染色。

4. 染色:

(1)初染: 加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗。

(2)媒染: 滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。

(3)脱色: 将载玻片上的水甩净,并衬以白背景,用95-酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约2030秒,立即用水冲净酒精。

(4)复染: 用番红液染12分钟,水洗。

5. 镜检: 干燥后,置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。

6. 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应

① 杀死微生物,固定其细胞结构;

② 保证菌体能牢固地粘附在载玻片上,以免水洗时被水冲掉;

③ 改变菌体对染料的通透性,一般死细胞原生质容易着色。

如果将细菌做革兰染色,凡是染后菌体呈蓝紫色的,称为“革兰阳性菌”;菌体是伊红色,称“革兰阴性菌”。无论阳性菌还是阴性菌,都有杆菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌是临床最为常见的病原菌,葡萄球菌属于革兰阳性菌,大肠杆菌属于革兰阴性菌中的肠杆菌科,除大肠杆菌以外,临床较常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌属,沙门菌属、克霉白菌属;铜绿假单胞菌是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。

细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异,主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物,乙醇能使它溶解,所以染色的前二步结果是一样的,但在G+细胞中,乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水,导致孔隙变小,由于结晶紫和碘的复合物分子太大,不能通过细胞壁,保持着紫色。在Gˉ细胞中,乙醇处理不但破坏了胞壁外膜,还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜,于是被乙醇溶解的结晶紫和碘的复合物从细胞中渗漏出来,当再用衬托的染色液复染时,显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞,但被紫色盖没,红色显示不出来。

①革兰氏阳性细菌的细胞壁

G+细菌细胞壁具有较厚(20-80nm)而致密的肽聚糖层,多达20层,占细胞壁成分的60-~90-,它同细胞膜的外层紧密相连(图2-9)。有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸(teichoic-acid),也称胞壁质(murein),它是甘油和核糖醇的聚合物,磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸带负电荷,它在细胞表面能调节阳离子浓度。磷壁酸与细胞生长有关,细胞生长中有自溶素(autolysins)酶类起作用,磷壁酸对自溶素有调节功能,阻止胞壁过度降解和壁溶。

如果细胞壁的肽聚糖层被消溶,G+细胞成为原生质体(protoplasts),细胞壁不复存在,而只存留细胞膜。除链球菌外,大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。

②革兰氏阴性细菌的细胞壁 Gˉ细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄(15~20nm)而结构较复杂,分外膜(outer membrane)和肽聚糖层(2~3nm)。在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间,称为壁膜间隙(periplasmic space)。

外膜 Gˉ细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同细胞质膜相同之处也是双层类脂,但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。

LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成,含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖)和二脱氧已糖。由于糖的种类不同,使各种Gˉ细胞具有不同特性的LPS。核心多糖(core polysaccharide)的主要组分是酮脱氧辛酸(ketodeoxyoctonate, KDO)。

外膜中还含有几种蛋白,如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用(porin),调控外界分子进入细胞;有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体;许多G-细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的,它的毒性组分常称为内毒素(endotoxins)。

肽聚糖层 Gˉ细菌细胞壁的肽聚糖层很薄,在大肠杆菌和其它细菌中仅有单

层。肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。

壁膜间隙 Gˉ细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙,一层薄的肽聚糖处于其间,肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽,肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄。大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12~15nm,呈胶胨态。其间含有三类蛋白质:水解酶,催化食物的初步降解;结合蛋白,启动物质转运过程;化学受体(chemoreceptors),在趋化性中起作用的蛋白。

革兰染色的医学意义 :

1、可以协助鉴定细菌

2、为临床使用抗生素提供依据

3、有助于了解分析细菌的致病性

1、涂片太厚 在涂片时细菌挑的太多,没法分开,在脱色时就不能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去,可能会使革兰阴性菌也出现紫色,误认为革兰阳性菌。
  2、脱色时间 阳性菌透性小,不易被脱色,阴性菌透性大,易脱色;但这是在固定的时间条件下的结果,如果延长脱色时间,也会使脱色剂渗透进阳性菌的细胞壁中,使染上的结晶紫脱去颜色,最后染上复红的颜色,变成革兰阴性菌。而脱色时间太短的话又会使阴性菌染上的结晶紫不能完全脱色,出现紫色,误认为革兰阳性菌。
  3、固定方法 固定不仅能杀死细菌,改变细菌对染料的通透性,还能使细菌吸附在玻片上,保持原有的形态结构。固定方法是将干燥后的细菌涂片以中等速度通过火焰三次,以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜。但在实际操作中有的同学将玻片在火焰上烤的太久,改变了细菌原有的通透性,会使细菌的染色性发生变化。影响了染色的结果。

1、细菌培养时间 细菌的典型形态、染色性是在对数生长期,取这时的细菌做革兰染色可以反应细菌的真实的染色性。如果细菌培养时间太长,变成了老龄菌,染色性就会发生变化,可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
  2、培养基的成分 一般认为革兰阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物,它与碘和结晶紫的复合物结合很牢,不易脱色。但是如果培养基中缺乏核蛋白质镁盐就不能合成菌体成分的核蛋白质镁盐,细菌与碘和结晶紫的复合物结合就不牢固,容易脱色,可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。

1、碘液 碘液作为媒染剂能增加染料与被染物的亲和力。如果碘液放置时间太长,或经日光照射失效,失去媒染剂的作用,就可能使结晶紫与细菌结合的不牢固,容易被脱色,使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
  2、结晶紫 结晶紫的浓度太高,就会使染上的颜色不容易被酒精脱色,可能会使革兰阴性菌染成革兰阳性菌。
  3、酒精 酒精作为脱色剂,革兰染色的脱色酒精浓度为95- ,在此浓度下革兰阳性菌染上的结晶紫不易被脱去,保留紫色,革兰阴性菌染上的结晶紫容易被脱去,最后呈红色。但当酒精的浓度为70- 时,它的脱色能力最强,可能使革兰阳性菌染上的结晶紫也被脱去,使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。 [1]

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