银染

银染是检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质,是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银,沉淀在蛋白质的表面上显色的原理。银染的方法种类很多,目前有文献报道的就有100多种。但是其准确的染色机制还不是特别地清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银,沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高,可染出胶上低于1 ng/蛋白质点,故广泛的用在2D 凝胶分析上,及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。

这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法,对关键操作及要求做了补充!主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测!如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究 。

实验目的:检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。

实验原理:在碱性条件下,用甲醛将蛋白带上的硝酸银银离子)还原成金属银,以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关,不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。

试剂:乙醇、冰醋酸(纯乙酸)、乙酸钠硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠甘氨酸EDTA. Na2.2H2O、甲醛

实验操作程序:

固定:30min或者更长时间 100ml 乙醇 40- 乙醇

25ml冰醋酸 10- 冰醋酸

加水到250ml

致敏:30min 75ml乙醇 30-乙醇

17g乙酸钠 28.2g三水乙酸钠

0.5g硫代硫酸钠(大苏打

加水到终体积250ml

水洗:3 x 10min

银染:20min 0.625g AgNO3

100ul 37-甲醛(在使用前加入)

加水到终体积250ml

水洗:2 x 1 min (注意把握时间,水洗时间长显色速度慢,点的颜色偏黄色)

显色:视情况而定 6.25 g Na2CO3

50ul 37-甲醛(在使用前加入)

加水到终体积250ml

终止:10min 3.65g EDTA. Na2.2H2O或者1g甘氨酸

加水到终体积250ml

保存:1-冰醋酸,4 ℃

1.固定时间较长,则加一步水洗30min,以免胶太脆而破碎。

2.甲醛在使用前加入。

3.最好多配制一份显色液,第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液,显色到点清晰。

4.显色过程很快,要注意把握时间,避免染色过度。

5.银染液和显色液需要预冷

6.所用器皿要很洁净,不用手直接接触,以免杂蛋白污染!

7.清洗用水尽量用高纯度去离子水蒸馏水更佳,可以减少背景着色。

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